口の中で、脱灰した象牙質のコラーゲンは分解される？——完全に脱灰した牛の象牙質を17人の部分床義歯に4週間付けたin situ研究で、コラーゲンは試料により0〜40.3%（平均14.5%）減ったが、唾液・象牙質のMMPや唾液のカテプシンBの測定値とは相関しなかった（van Strijp 2003）

①口の中で、脱灰した象牙質のコラーゲンはどれくらい分解される？

根面う蝕は、象牙質の無機質が酸で溶けたあと、残った有機質（主にI型コラーゲン）が分解されて進みます。この分解を担う酵素として、細菌が出す酵素のほかに、唾液や歯肉溝滲出液（GCF）に含まれるヒト由来の酵素――MMP（マトリックスメタロプロテアーゼ）やカテプシン――が考えられてきました。

では、口の中に置いた脱灰象牙質のコラーゲンは実際にどれくらい減るのか。そして、その減り方は唾液や象牙質に含まれる酵素の量で説明できるのか。これを、ヒトの口の中に装置で試料を置く in situ（イン・サイチュ）研究で調べたのが、オランダ・アムステルダムの ACTA の van Strijp らが2003年に Caries Research に出した論文です。

②なぜこの研究が必要だったか

著者らは序論で、高齢になっても歯が残るようになり、根面う蝕はこれから増える問題だと書いています。根面う蝕は、脱灰に続いてコラーゲンの基質が分解されて進み、この分解が窩洞ができる前提になります。

細菌の酵素については、う蝕象牙質から分解酵素を出す菌は見つかるものの、象牙質のコラーゲンを直接分解しているかははっきりしない、と著者らは自分たちの過去の研究を引いています。一方、ヒト由来の MMP は歯垢・GCF・唾液に存在し、う蝕象牙質からも見つかっていました。システインプロテアーゼのカテプシンは、弱い酸性（pH 5.0〜6.5）でも働き、I型コラーゲンを分解できるとされます。

そこで著者らは「ヒト由来の MMP とカテプシンが、象牙質の基質の分解に関わっている」という仮説を立て、口の中に置いた脱灰象牙質で、酵素の存在・活性とコラーゲンの減り方の関係を調べました。

③何をどう調べたか

・参加者：部分床義歯を昼も夜も使っている17人（女性11人・男性6人、46.3〜79.8歳・中央値61歳）。6人は義歯に試料を2個付けられたので、試料は計23個
・試料：屠畜場で集めた牛（4歳以上）の中切歯から、唇側の象牙質を厚さ400µm（表面積28.2mm²）の薄片に切り出し、0.1mol/Lの酢酸（pH 4.5）で9日間かけて完全に脱灰した
・付け方：試料をテフロンの円盤に入れ、ダクロンのガーゼで覆って義歯に付けた（プラークが溜まりやすくし、咀嚼の力から守るため）。試料は磨かないよう指示し、開始1週間前から期間中はフッ化物の入っていない歯磨剤を使ってもらった
・唾液：開始時・2週・4週に、刺激しない唾液を集めた（計51検体）
・4週後：試料を外して酵素を抽出し、コラーゲン量をヒドロキシプロリンの量から求めた（7.98倍してコラーゲン量に換算）。口に入れなかった対照の試料10個も同じように測った
・酵素：ゼラチンを分解する酵素をザイモグラフィ（電気泳動で酵素のバンドを見る方法）で検出し、MMP用の蛍光基質で MMP-1 の活性と、主に MMP-2・MMP-9 による活性（MMP-2/MMP-9）を測った。唾液ではカテプシンBの活性も測った
・統計：コラーゲン量は対照と対応のないt検定で比べ、酵素とコラーゲンの減り方の関係はスピアマンの順位相関で調べた。唾液の解析では、試料を2個付けた人はその平均の減り方を使った

④結果1：コラーゲンは平均14.5%減ったが、試料によって0〜40.3%とばらついた

口に入れなかった対照の試料（10個）のコラーゲン量は平均2.87 mg（標準偏差0.25）でした。4週間口の中に置いた試料（23個）は1.71〜3.20 mgで、平均2.49 mg（標準偏差0.39）。対照より統計的に有意に少なくなっていました（対応のないt検定、p=0.003）。

ただし、減り方は試料によって大きく違いました。0〜40.3%の幅があり、平均14.5%・中央値13%。5個の試料は減っていませんでした。同じ4週間・同じ付け方でも、人や試料によって分解の進み方がかなり違った、ということです。

⑤結果2：酵素は見つかったが、減り方とは相関しなかった

唾液では、ザイモグラフィで全検体にゼラチン分解活性が見られ、不活性な前駆体の pro-MMP-2 は51検体中50、pro-MMP-9 は42で見られました。蛍光基質で測った活性は、MMP-1 が48検体（1.5〜101.1 RFU/s）、MMP-2/MMP-9 が48検体（1.7〜141.1 RFU/s）で検出されました。カテプシンBの活性は、参加者ごとの平均で4.8〜42.2（任意単位／分）でした。

象牙質の抽出液では、23個中1個を除いてザイモグラフィでゼラチン分解酵素が見られ（pro-MMP-2 は7個、pro-MMP-9 は8個）、MMP-1 の活性は全23個（3.5〜295.0 RFU/s）、MMP-2/MMP-9 の活性は15個（0.2〜13.7 RFU/s）で検出されました。

そして、唾液でも象牙質の抽出液でも、酵素のバンドの濃さ・活性と、コラーゲンの減り方の間に相関は認められませんでした（表）。象牙質の抽出液では、試料の分解の程度に合わせて泳動する量を補正したザイモグラフィも追加で行いましたが、やはり相関は認められなかったと書かれています（数値の記載なし）。唾液の量と、MMP-2・MMP-9 の有無やコラーゲンの減り方の間にも相関は無かったと書かれています。

一方、唾液の中では、参加者ごとの平均でカテプシンBの活性と MMP-1（rs=0.740、p=0.001）・MMP-2/MMP-9（rs=0.798、p=0.0001）の活性が有意に相関していました。酵素どうしは連れ立って多かったり少なかったりしたが、それがコラーゲンの減り方には結びついていなかった、という形です。

⑥著者らの結論と考察

著者らは、MMP-1・MMP-2/MMP-9・カテプシンBの活性と、口の中での象牙質コラーゲンの分解との間に、直接の相関は無かったと結論しています。そして、唾液の MMP の活性を、う蝕の過程での象牙質コラーゲン分解の目安（マーカー）に使うのは適さない、と述べています。

相関が出なかった理由として、考察では次の可能性を挙げています。いずれも著者らの解釈で、この研究で確かめたものではありません。

・プラークの細菌の酵素や、酸・毒素などが分解に関わった可能性は否定できない（細菌は調べていない）
・酵素の活性は時間とともに変わるので、測った時点の値が4週間の分解を表していないかもしれない
・ザイモグラフィには、コラーゲンを分解できない前駆体や、阻害因子（TIMP）と結びついた酵素も写る
・象牙質から抽出した MMP が、象牙質にもともとあったものか、唾液から吸着したものかは区別できなかった
・口腔清掃の状態は期間中に記録していない（開始時、全員にプロービング時の出血と歯石があったが、歯周ポケットは無かった）

⑦明日の臨床へ

この研究から持ち帰れるのは、次のような読み方です（筆者の読み）。

「唾液の酵素を測れば根面う蝕の進み方が分かる」という段階ではない、と受け取るのが無難です。修復や接着の成績を調べた研究ではないので、そちらへ話を広げずに読みたい一本です。