材料は「我慢される」のが最良だと思われていた——MTAと接した骨系細胞だけがIL-1α 80.1・IL-1β 31.7・IL-6 76.1 pg/mLを出し、細胞のみとIRMでは検出限界以下だった（1998年・細胞培養）

1問1答論文エンド

エンド｜犬の切除根面でMTAの上にセメント質が乗った現象の「なぜ」を、石灰化しうる基質を作れる細胞で調べた研究。走査型電子顕微鏡による形態観察と、サイトカインのELISA定量を組み合わせた（Koh 1998・Journal of Endodontics）

逆根管充填材の生体適合性を調べた研究の多くは、材料が組織に「許容される」ことを到達可能な最良の状態と考えてきました。ところが1995年の報告で、犬の切除根面に置いたMTAの上に、10週を超えた根では、量にばらつきはあるもののすべてセメント質が沈着していた。硬組織、それもセメント質の形成を促した逆根管充填材はほとんど例がありません。そこで著者らは問いをひっくり返します——なぜMTAはセメント質形成を促すように見えるのか。使ったのはヒト骨肉腫由来の骨芽細胞様細胞株MG-63で、MTAとIRM（近年よく使われる逆根管充填材という理由で選ばれた比較対象）を同じシャーレに置き、1・3・7日目の形態を走査型電子顕微鏡で、1〜144時間のサイトカイン産生をELISAで測りました。結果、1日目と3日目のMTA上の細胞は平坦でセメントに接着して伸びていたのに対し、IRMの近くの細胞は球状になり数も疎ら。72時間かけて熟成させたIRMも新鮮なIRMと同程度に毒性が高く（著者らは硬化が進めば毒性が下がると期待していた）、毒性成分はユージノールとされています。そしてELISAでは、MTAと一緒に培養した細胞だけがIL-1α（72時間で80.1 pg/mL）・IL-1β（31.7）・IL-6（76.1）を全時点で産生し、細胞のみの群とIRM群では検出できませんでした。一方M-CSFは材料の有無にかかわらずどの群でも産生され、72時間の平均はIRM 7478・MTA 7055・細胞のみ7032 pg/mLとほぼ同じでした。

論文: Cellular Response to Mineral Trioxide Aggregate
著者: Eng Tiong Koh, Fraser McDonald, Thomas R. Pitt Ford（United Medical and Dental Schools 保存歯科学・英国ロンドン）, Mahmoud Torabinejad（ロマリンダ大学歯内療法学・米国）
掲載: Journal of Endodontics 1998;24(8):543-547
種類: 細胞培養によるin vitro試験。細胞＝ヒト骨肉腫由来の骨芽細胞様細胞株MG-63（入手しやすさと培養のしやすさで選択。サイトカイン産生に関する反応がヒト骨芽細胞と同様であることが示されていると注記）。Ham’s F12とDMEMを1：1で混合した培地、5%CO₂・95%空気・37℃でコンフルエントまで培養。材料＝MTA（重量比で粉：滅菌蒸留水＝3：1）とIRM（粉液比6：1）。IRMは、混和した約20〜25mgをカバーガラスに置き培地を加えて72時間熟成させた群も用意した（より完全に硬化させれば毒性が下がるという期待から）。細胞は1シャーレあたり約10⁵個で播種し、材料を載せたカバーガラスを投入。材料なしのカバーガラスを対照とした。形態評価＝1・3・7日後に各群4枚のシャーレを取り出し、リン酸緩衝2.5%グルタルアルデヒドと1%四酸化オスミウムで固定、脱水・臨界点乾燥後に金を15nm厚でスパッタコートし、走査型電子顕微鏡（Hitachi S250・×500未満）で計48枚のカバーガラスを観察。スコア＝1：平坦（萎縮10%未満）／2：一部球状（50%未満）／3：球状（90%未満）／4：細胞死（生存10%未満）。サイトカイン評価＝各群・各時点6検体（対象はMTA・新鮮なIRM・細胞のみの3群で、熟成させたIRMは形態観察のみ）。1・6・12・24・48・72・144時間で培地1mLを回収し−20℃で保存、サンドイッチELISA（Quantikine）でIL-1α・IL-1β・IL-6・M-CSFを定量（標準曲線は250〜0 pg/mLの2倍希釈系列、450nmで吸光度測定）
PMID: 9759017

①「我慢される」が最良だと思われていた

逆根管充填材の生体適合性を調べた研究の多くは、材料が組織に”許容される”ことを到達可能な最良の状態と考えてきました。炎症を起こさず、隔離もされず、ただ静かにそこにある——それで十分だ、と。

ところが1995年の報告で、奇妙なことが起きていました。犬の切除根面に置いたMTAの上に、10週を超えた根では、量にばらつきはあるもののすべてセメント質が沈着していたのです。硬組織、それもセメント質の形成を促した逆根管充填材はほとんど例がありません。

そこでこの研究は問いをひっくり返します。なぜMTAはセメント質形成を促すように見えるのか——それを、石灰化しうる基質を作れる細胞を使って調べよう、と。

結論を先に言うと、MTAと接触した骨芽細胞様の細胞は、IL-1α（80.1 pg/mL）・IL-1β（31.7 pg/mL）・IL-6（76.1 pg/mL）を産生しましたが、細胞だけ・IRMと一緒の群では検出限界以下でした（いずれも72時間値）。

②細胞培養で材料を調べるということ

歯内療法材料の評価に細胞培養を持ち込んだのはRappaportらです。この分野には決まりごとがあります。

使うのは確立された細胞株（異数性の染色体を持ち、急速に増え、寿命に限りがない）。寿命が有限な初代培養より、培養しやすく表現型が予測しやすいためです。どの細胞種を使うべきかの合意は無いので、材料同士の相対的な細胞毒性を見るなら培養しやすい細胞株でよい——という立場が取られています。

当時使えた生体適合性の評価法は、寒天オーバーレイ法・モデル窩洞法・ミリポアフィルター法・放射性クロム遊離法。著者らはそれぞれの長短を挙げています。

モデル窩洞法の弱点は、材料と標的細胞が直接接触しないため相互作用が乏しく、水溶性の成分しか培地へ拡散せず、しかも希釈されすぎること。ミリポアフィルター法は寒天オーバーレイとモデル窩洞の利点を併せ持ち、酵素の存在下で細胞を培養できる。放射性クロム法は優れた同位体で、クロム酸ナトリウムが細胞を傷つけない。

そして著者らは自分の新しさを明言します。走査型電子顕微鏡で細胞の形態を見ることと、サイトカインの産生を細胞毒性の指標にすることは、逆根管充填材では前例がないと。

③今回の一手：形を見て、細胞が何を出すかを測る

細胞＝ヒト骨肉腫由来のMG-63細胞株（骨芽細胞様）。Ham’s F12とDMEMを1：1で混ぜた培地、5%CO₂・37℃でコンフルエントまで培養。この細胞株を選んだ理由は入手しやすさと培養のしやすさで、サイトカイン産生に関する反応がヒト骨芽細胞と同様であることが示されていると注記されている。

材料は2つ。MTAとIRM（近年よく使われる逆根管充填材だから、という理由で比較対象に選ばれています）。IRMは粉液比6：1、MTAは重量比で粉：水＝3：1（滅菌蒸留水）。

IRMについては工夫があり、混和したIRM約20〜25mgをカバーガラスに置いて培地を加え、72時間かけて「熟成」させた群も用意しました。より完全に硬化した材料なら毒性が下がるのではないか、という期待です。

形態の評価＝1・3・7日後に各群4枚のシャーレを取り出し、2.5%グルタルアルデヒドと1%四酸化オスミウムで固定。脱水・臨界点乾燥のうえ金を15nm厚でスパッタコートし、走査型電子顕微鏡（×500未満）で観察。計48枚のカバーガラスを見た。スコアは1＝平坦、2＝一部球状、3＝球状、4＝細胞死。
サイトカインの評価＝各群・各時点6検体。対象はMTA・新鮮なIRM・細胞のみの3群（熟成させたIRMは形態観察のみで、サイトカイン測定の対象外）。1・6・12・24・48・72・144時間で培地を回収し、サンドイッチELISA（Quantikine）でIL-1α・IL-1β・IL-6・M-CSFを定量した。

④結果①：細胞は、MTAにくっついて平らに伸びていた

細胞形態のスコア中央値（原著Table 1）

1日目と3日目、MTAと接した細胞は平坦で、セメントに接着して伸びていました。対照（材料なし）はコンフルエントまで増殖。対してIRMの近くの細胞は球状になり、数も疎らでした。

興味深いのは熟成させたIRMも新鮮なIRMと同程度に毒性が高かったことです。著者らは硬化が進めば毒性が下がると期待していましたが、そうなりませんでした。IRMの毒性成分はユージノールだと述べられています。

ただし7日目はMTAもスコア4（細胞死）になり、材料なしの対照も3へ落ちています。この論文の本文と抄録が語っているのは「1日目と3日目にMTA上の細胞が健常だった」ことであり、7日目の落ち込みについて考察はありません。原著に説明が無いので理由は分かりません（培養そのものの限界だった可能性もあります）。いずれにせよ「MTAなら細胞がいつまでも元気」という話ではない点は押さえておきたいところです。

⑤結果②：MTAの上の細胞だけがサイトカインを出した

72時間後のインターロイキン濃度（原著本文）

ELISAの結果は明瞭でした。MTAと一緒に培養した細胞は、すべての時点でIL-1α・IL-1β・IL-6を産生（72時間でそれぞれ80.1・31.7・76.1 pg/mL）。ただし著者ら自身は考察で「少量のIL-1α・IL-1β・IL-6が産生された」という言い方をしています。一方細胞だけの群とIRM群では、これら3種は検出できませんでした。

ここで対照になるのがM-CSF（マクロファージコロニー刺激因子）です。こちらは材料の有無にかかわらずどの群でも産生され、24時間以降に高値となり、72時間の平均はIRM 7478・MTA 7055・細胞のみ7032 pg/mLとほぼ同じでした。つまり「細胞が生きていれば出るもの」と「MTAがあるときだけ出るもの」が分かれた、ということです。

⑥なぜサイトカインなのか——骨形成の2つの相

サイトカインは低分子の糖タンパクで、細胞が刺激を受けたときに分泌され、他の細胞の受容体に結合してRNAとタンパクの合成を変え、細胞の振る舞いを変えます。そして骨代謝の調整に関わっている。

著者らの整理では、骨形成は2つの相に分けられます。第1相＝骨芽細胞前駆細胞の動員と分化。第2相＝成熟した骨芽細胞による骨基質の産生と石灰化。
そして骨形成に関わるサイトカインも2群に分かれる。第1群は骨系細胞の増殖を促すが、成熟した骨芽細胞は抑制する（IL-1やM-CSFがここに入る）。第2群は前駆細胞の増殖と成熟骨芽細胞の活動の両方を促す。前駆細胞を刺激することは、次の相に向けた準備として行われる、というのが著者らの読みです。

この枠組みに乗せると、MTAがIL-1を出させていることは「骨形成の第1相のスイッチが入っている」と解釈できます。犬でMTAの上にセメント質が乗ったこととつながる筋道です。ただし著者らの2群分類に挙げられているのはIL-1とM-CSFだけで、IL-6は分類されていません。しかもその第1群のもう一方であるM-CSFは、この実験では全群で同じように産生されていました。

著者らは自分の測定の限界も書いています。この研究が測ったのはインターロイキン産生の累積量であって、時間ごとの産生量の推定ではありません。3日目にIL-1αとIL-6が目立って減っているのは、細胞数が増えたことによる産生への抑制的なフィードバックかもしれず、そのあと増えたのはおそらく細胞数の増加による——という説明にとどめています。

⑦明日の臨床へ

・IRMの毒性成分はユージノールで、硬化を待っても下がらなかった。「置いてしばらく経てば落ち着く」とは限らない。
・MTAの生体適合性は「害が少ない」だけでなく、細胞が接着して平らに伸びる足場になるという積極的な性質として観察された。
・犬で見えた「MTAの上にセメント質が乗る」現象には、骨系細胞のサイトカイン産生という分子の裏づけが与えられた。ただしこれは仮説を支持する所見であって、証明ではない。
・材料の評価を読むときは、どの試験法かを必ず見る。直接接触しない方法では、水溶性成分しか効かず、しかも薄まる。

⑧ここだけ、冷静に補助線

ヒト骨肉腫由来の不死化細胞株を使った試験管内の実験です。著者ら自身が序論で「in vitroの手法の多くは極めて鋭敏で、生体内で起こりうる反応を過大に述べてしまうことが多い」と書いています。加えてどの細胞種を使うべきかについての合意は無いとも。細胞株はヒトの骨芽細胞そのものではなく、セメント芽細胞でもありません（調べたかったのはセメント質形成なのに、使ったのは骨系の細胞株）。測定は累積量であり、7日目にはMTA群も対照群も形態が崩れています。また利益相反の補助線として。原著が書いているのは材料の供給元が「ロマリンダ大学」であることと、MTAの開発を報告した文献の筆頭著者であり同大学の歯内療法学講座に所属するTorabinejad氏が共著者に入っていることまで。共著者のPitt Ford氏も、本文で引用されるMTAの先行研究のほとんどに名を連ねています。論文には資金源や利益相反の記載がありません。それでも、「材料は我慢されるのが最良」という前提を疑い、材料が細胞に何をさせているかを測りにいったという着眼は、MTAという材料の理解を一段深くしました。

今日のひとこと

著者らの結論：MTAは骨系細胞にとって生物学的に活性な足場となり、インターロイキンの産生を促すと考えられる。1日目と3日目、MTAと接した細胞は平坦でセメントに接着して伸びていたのに対し、IRMの近くの細胞は球状で疎ら。しかも72時間熟成させたIRMも新鮮なものと同程度に毒性が高く、硬化の進行では解決しませんでした（毒性成分はユージノール）。ELISAではMTA群だけがIL-1α・IL-1β・IL-6を全時点で産生し、細胞のみとIRM群では検出限界以下。対照的にM-CSFはどの群でも同じように産生された（72時間でIRM 7478・MTA 7055・細胞のみ7032 pg/mL）ので、「細胞が生きていれば出るもの」と「MTAがあるときだけ出るもの」が分かれたことになります。著者らはこれを骨形成の枠組みに置きます——骨形成は第1相（骨芽細胞前駆細胞の動員と分化）と第2相（成熟骨芽細胞による基質の産生と石灰化）に分かれ、IL-1やM-CSFは骨系細胞の増殖を促すが成熟骨芽細胞は抑制する群に属する。前駆細胞への刺激は次の相に向けた準備である、と。筆者の読みでは、この論文の値打ちは数値より「材料は我慢されるのが最良」という前提を疑い、材料が細胞に何をさせているかを測りにいった着眼にあります。ただし不死化細胞株を使った試験管内の実験であり、著者ら自身が「in vitroの手法の多くは極めて鋭敏で、生体内で起こりうる反応を過大に述べてしまうことが多い」と序論で明記しています。7日目にはMTA群も対照群も形態が崩れており、観察されたのは1〜3日目の差です。